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流式实验中的抗体滴定
点击次数:154 发布时间:2019-07-16

一般我们购买商品化的primary antibody的时候,抗体的说明书中都会给我们一个推荐的抗体使用浓度。这个浓度在一定程度上来说,是过饱和的,可以满足大多数实验的染色需求。

但是因为是过饱和的浓度,这就带来了一定程度的抗体浪费。而过量的抗体,也会大大提高样本的自发荧光。

 

 

 

从另一个角度来看,因为厂家给出的推荐浓度都是基于一个特定的样本浓度和样本体积,所以在一些特殊的实验中,比如样本浓度或样本体积过大的实验,推荐的浓度就无法达到饱和滴加的要求。在这样的前提下,推荐实验用户针对自己的实验要求,zui好可以对抗体进行滴定。节约成本的同时,也可以让自己的实验更加精确。

滴定的原则:

1. 在进行滴定实验前,应该遵守一个实验一个变量的原则。既然滴定实验要求的是摸索出准确的抗体工作浓度,那在制作样本前,也需要对其他的实验条件进行统一。而这些在滴定实验中的条件,也应该沿用到后续的正式实验中去。

2. 需要统一的条件:样本,样本数量/管,样本体积/管,孵育条件等。总的来说,一个成功的滴定实验,只应该有“抗体的终浓度不同”这一个实验中的变量。

3. 滴定的稀释倍数:一般按照5倍稀释的标准做5个梯度的原则做滴定实验。也可根据自己的实验进行适当调整。起点浓度的选择则需要按照具体的实验进行分析。比如,对于PBMC或者裂解后的全血、脾脏之类的样本,活细胞比例高,单管样本一般以1*10^6为上限。可以从推荐用量开始,往下5倍稀释,做5个梯度。但是有些原代细胞,比如涉及肿瘤免疫方面的样本,活细胞比例低,免疫细胞的浸润比例低,所以制备的样本数量也会比较大,这个时候,也可以选择超过推荐的浓度滴加,然后再进行梯度稀释。

4. 滴定实验完成后,通过计算染色指数(stain Index)确定zui佳抗体浓度。染色指数公式如下:

 

 

 

示例:

我们以anti-human CD3抗体举例:在100ul全血样本中,我们以该抗体推荐的用量5ul/tube 为最高浓度,5倍稀释,并设置5个梯度。最高浓度至最低浓度分别是5ul/100ul blood,1ul/100ul blood,0.2ul/100ul blood,0.04ul/100ul blood,0.008ul/100ul blood。通过计算,染色指数由高浓度到低分别为98.57,106.29,96.97,12.36,8.58。从染色指数上看,我们挑选出zui优的抗体浓度为1ul/100ul blood。即为推荐用量的1/5。

 

 

 

 

用第三方软件进行数据叠加可以一目了然。

 

 

注意事项:

1. 对于一些阳性表达几乎100%的细胞,比如PBMC中的CD45,可以在样本染色后少量加入未染色的细胞。

2. 对于表达量比较少的稀有细胞群体,在染色时,可加入该群细胞的父级细胞群的抗体。在设计多色实验的滴定时,zui好可以分批滴定。将表达量高的抗体先进行滴定。确定zui佳浓度后,再滴定表达量少的抗体,并将已经滴定好的抗体一同加入。比如我们在滴定外周血中的foxp3时,zui好可以加入已经确定好浓度的CD4抗体。

3. 对于消化的组织来说,因为存在大量的死细胞,所以在这些样本的滴定过程中,要先加入死活染料区分死活,再确定目标抗体的浓度。

4. 是否需要在滴定前blocking?取决于正式实验。如果正式实验是封闭的,那么滴定实验也需要。

5. 遇到不同厂家,不同货号,不同克隆号的抗体,需要重新滴定。

6. 滴定完成后,理论上只要cat号一致,lot号不一致,不需要重新滴定。但是为了保险起见,每一瓶抗体,特别是不同lot的抗体,zui好留一个样本的抗体量,以方便日后的QC或者实验复盘。


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